高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体的原理、步骤、注意事项

原理

根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。

材料与仪器

PBS
缓冲液
层析柱 高效液相色谱仪

步骤

1. 腹水10000 g离心10 min，除去细胞和杂质，在4 ℃条件下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40 ％饱和硫酸铵搅拌20～30 min

2. 离心，沉淀用40 ％饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A（PH8.5 20 mM Tris缓冲液）透析除盐4 ℃过夜

3. 用带有1000 μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK DEAE SPW离子交换层析柱

4. 洗脱流速1 ml/min

0～1 min：0→5％缓冲液B（20 mM Tris，PH8.5，含2.0 M醋酸钠）

1～20 min（线性梯度洗脱）：5→20％缓冲液B

20～22 min：20→0％缓冲液B

5. 洗脱液用紫外280 nm进行监测

6. 收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定

注意事项

1. 所用缓冲液和加样粗提物均需0.22 μm滤膜过滤。

2. 在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11～12 min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间（retention time）有所差异。

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