串联亲和纯化技术法所用试剂、操作步骤及注意事项

简介

串联亲和纯化技术法是由 Rigaut 等于 1999 年建立的能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术，用于在接近细胞真实生理状态的条件下纯化细胞体内的蛋白质复合体。

材料与仪器

器材：SDS- PAGE 电泳装置、离心机、EP 管、水浴锅。

试剂：

① IgG Sepharose 6 Fast Flow matrix

② AcTEV protease

③ Calmodulin Affinity Resin

④ NP-40 缓冲液

⑤ IPP150 缓冲液

⑥ TEVCB 缓冲液

⑦ CBB buffer（0.1％ 和 0.02％）

⑧ CEB buffer

步骤

串联亲和纯化技术法的基本过程可分为如下几步：

（一）细胞裂解及蛋白样品的制备

A. 悬浮细胞：1400 r/min，4℃ 离心 5 分钟，用预冷的 PBS 洗 3 次，按 1ml/107 个细胞加入 NP-40 裂解液，冰箱内垂直摇床裂解 60 分钟，12000 r/min，4℃ 离心 20 分钟，回收上清，即为细胞的蛋白裂解液。

B. 贴壁细胞：用预冷的 PBS 洗 3 次，加入 NP-40 裂解液 1ml（90 mm 培养皿），冰上放置 10-60 分钟，吹打细胞并移入 15 ml 离心管中，12 000r/min4℃ 离心 20 分钟回收上清，即为细胞的蛋白溶解液。细胞裂解液短期可 4℃ 保存或-80℃ 长期保存。

（二）IgG 亲和层析

A. 取 500μl IgG-琼脂糖微珠和 NP-40 裂解液 1：1（V/V）混合，加入上一步得到的上清中，4℃ 摇床孵育 3 小时。

B. 4℃，1200r/min 离心 2 分钟，缓慢除去上清，注意不要触及底部沉淀。

C. 用预冷的 IPP150 缓冲液洗沉淀 3 次，每次 10 ml。

（三）TEV 酶切

A. 将上一步得到的沉淀转移至 1.5 ml 离心管中，用预冷 TEVCB 缓冲液洗涤三遍，每次 1 ml。

B. 加入含有 20 个单位 AcTEV 蛋白酶的 TEVCB 缓冲液 1 ml，室温反应 2 小时或 4℃ 摇床过夜。

C. 12000r/min 离心 1 分钟，收集上清（约 1 ml），转移至 15 ml 离心管中。

（四）钙调蛋白亲和纯化

A. 将 6ml 0.1％CBB 缓冲液加入上一步得到的 IgG 纯化洗脱液中。

B. 取 250μl 的钙调蛋白亲和微珠，用 1ml 0.1％CBB 缓冲液洗涤 3 遍。

C. 微珠与 0.1％CBB 缓冲液 1：1（V/V）混合，加入到 IgG 纯化洗脱液中，4℃ 摇床孵育 3 小时。

D. 1200r/min 离心 2 分钟，10ml 0.02％CBB 缓冲液洗沉淀 3 次。

（五）EGTA 洗脱

A. 将上一步得到的钙调蛋白微珠沉淀转移至 1.5ml 离心管，加入 100-200μl 的 CEB 缓冲液，4℃ 摇床孵育 2 小时。

B. 1200r/min 离心 2 分，收集上清，用于 SDS-PAGE 或免疫印迹分析。

（六）蛋白质电泳分离（SDS-PAGE）

A. 安装电泳装置和玻璃板。

B. 配制分离胶：按照所需浓度和体积依次混合 H20,30％ 丙烯酰胺，1.5mol/L Tris（pH8.8），10％SDS，10％ 过硫酸铵，最后加入 TEMED，立即快速混匀。

C. 迅速在两玻璃板间隙灌入分离胶溶液，留出沉积胶所需体积和梳子齿长高度。小心地在胶上覆盖一层去离子 H20，垂直放置于室温中，约 30 分钟使胶凝聚。

D. 倒出分离胶上方覆盖液体，尽量吸干。

E. 配制 5％ 浓缩胶，依次混合 H20,30％ 丙烯酰胺，1.5mol/L Tris（pH8.8），10％SDS，10％ 过硫酸铵，最后加入 TEMED，立即快速混匀。

F. 在分离胶上方灌入浓缩胶，并插入梳子，避免气泡！再灌入适量浓缩胶填满梳子齿间缝隙，垂直放置于室温。

G. 将蛋白样品加入等量 2 x SDS 加样缓冲液，100℃ 加热 3 分钟使蛋白变性。2000r/min，常温离心 3 分钟。

H. 取出浓缩胶中梳子，以 H2O 去除未聚合丙烯酰胺。将凝胶装置固定于电泳装置中，在上、下槽均加满 Tris-Glysine 电泳缓冲液。

L. 加样 10-20μl。

I. 将电泳装置通电，电压 8V/cm，当染料前沿进入分离胶后，电压提高到 15V/cm，电泳至溴酚蓝到达胶底部，约 2-4 小时。

J. 关闭电源，取出玻璃板，撬开玻璃板，小心取出凝胶。

7. 考马斯亮蓝染色或银染。

8. 质谱分析蛋白质复合物的组成。

注意事项

1．实验设计 在开始 TAP 实验前，需要考虑以下几点：

① 确认靶蛋白中不存在 TEV 酶的识别位点：EXXYXQ（G／S）；

② 根据不同蛋白质的结构，确定 TAP 标签位于靶蛋白的 N 端还是 C 端，以不影响靶蛋白的正常折叠和功能为准则；

③ 靶蛋白的表达量：通常不推荐使用过表达来进行 TAP 纯化，这会影响细胞的生理环境，提高实验假阳性，因此使用内源性启动子较为合适；

④ 选择适合的 TAP 标签：最初的 TAP 标签由 Protein A 和钙调蛋白组成，但此标签分子量较大，可能会影响靶蛋白的折叠；现已有由 Protein A 和 Flag 等组成的 TAP 标签，在保持高亲和力的同时减少对靶蛋白的干扰，可以从优选择；

⑤ 对照：比较好的对照是含有 TAP 标签但不含有靶蛋白的细胞株，提高实验特异性。

2．由于整个实验过程较长、步骤较多，建议在每步洗脱时留取少量洗脱液，在实验结果不理想时可以帮助发现和解决潜在的问题。

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