疏水作用层析法（蛋白质纯化实验）原理及步骤

原理

在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝大多数情况起作用的是苯基或辛基。当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水强的少量蛋白质被吸附。这时疏水相互作用太强，需用特殊方法洗脱，可能会导致蛋白质变性。苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常用介质，尤其是试用于纯化开始时。

疏水相互作用介质

苯基琼脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-C6H5

辛基琼脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-（CH2）7-CH3

溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强。因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。所以在硫酸铵沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进行疏水层析纯化。温和的洗脱条件及高蛋白质结合容置（10～100 mg/ml）使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的方法，也是更换缓冲液的方法之一。

材料与仪器

蛋白质样品液
苯基琼脂糖 CL-4B NaCl 硫酸铵 磷酸钠盐
层析柱

步骤

下述方案设定样品是在 75％ 硫酸铵沉淀后溶在 50％ 硫酸铵溶液的情况。

1. 装填 5 ml 苯基琼脂糖 CL-4B 进入柱内；

2. 10 倍柱床体积层析缓冲液（20 mmol/L，pH 7.0 磷酸钠盐，50％ 硫酸铵）洗柱；

3. 调整样品液符合要求，即在 pH 7.0 磷酸钠缓冲液中含 50％ 硫酸铵。上样总蛋白量 200～500 mg；

4. 3 倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至 A280 值回到基线；

5. 用分步梯度法洗脱。每步依次分别采用两倍体积各含 40％、30％、20％、10％ 或 0％ 硫酸铵的 pH 7.0 磷酸钠缓冲液洗脱；

6. 再依次用 5 倍体积水、5 倍体积 1 mol/L NaCl 和 5 倍体积水洗柱，使其获得再生。

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