免疫细胞（ICC）实验常见问题有哪些？

免疫细胞化学 (ICC) 是一种使用荧光抗体或染料来检测细胞内靶抗原的技术。那么免疫细胞（ICC）实验常见问题有哪些？让我们一起来看看吧！

一、荧光信号弱

1. 样品质量

选用新鲜制备的样本以及适当的保持条件。

2. 靶标丰度低

适当提高一抗浓度。

选择荧光强度更强的二抗。

3. 固定方法不当

甲醛和蛋白的氨基通过共价键结合，可能会遮盖抗原表位，导致靶表位信号减弱。建议调整抗原修复方法或固定方法。

多聚甲醛会与GFP荧光蛋白发生醛化反应，导致信号减弱。

检测膜蛋白一般不建议使用甲醇或丙酮固定，有机溶剂能够破坏膜结构。

4. 透化方法不当

检查靶标蛋白表达位置，胞内蛋白需要透化处理。

膜蛋白需要考虑所检测靶表位位于膜内还是膜外，膜外则不需要透化。

5. 信号放大不够

如果检测靶点是低丰度蛋白．信号弱可能是由于信号放大不足导致的，可以使用Invitrogen SuperBoost 酪胺信号放大技术，进一步增强信号，实现低丰度，难以检测蛋白的检测。

二、背景太高

1. 封闭不足

（1）选用二抗种属来源的血清封闭。

（2）选用链霉亲和素/生物素系统，需要用链霉亲和素封闭内源的生物链酶。

（3）选用HRP系统，需要使用过氧化氢等商业化试剂盒去活化内源性HRP。

（4）选用AP系统，需要使用左旋咪唑等商业化试剂去活化内源性磷酸酶。

2. 一抗

一抗浓度过高，减少用量

3. 二抗

（1）设置无一抗对照，帮助确认背景是否来源二抗。

（2）二抗浓度过高，减少用量。

（3）抗体凝聚，使用二抗前离心去掉抗体凝聚物。

（4）使用高交叉吸附的Alexa Fluor Plus二抗，信噪比比Alexa Fluor提高4-5倍。

4. 自发荧光

（1）设置自发荧光对照，确定是否自发荧光。

（2）固定剂如醛类和氨基共价结合导致的自发荧光，可用硼氢化na去除。

（3）增加固定剂的漂洗次数。

（4）避开背景高的波段，选用背景较低的波段检测。

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